Авторы: Гуреева Ольга, Vincent R. Racaniello

4.1. Скопление вирусов гриппа

При обсуждении размножения вируса гриппа мы остановились на стадии синтеза вирусной РНК. В последний раз мы говорили о формировании вирусных РНК – процессе, который происходит в ядре клетки. Теперь мы рассмотрим, как эти РНК участвуют в скоплении новых инфекционных вирусных частиц (рис. 22).

Рисунок 22.

Для большей наглядности ядро не показано. Однако следует помнить, что вирусные РНК должны быть экспортированы из ядра в цитоплазму, где происходит вирусное скопление. Вначале транслируются вирусные мРНК для производства всех белков, необходимых для синтезирования новой вирусной частицы. мРНК, кодирующие гликопротеины HA и NA, транслируются рибосомами, которые прикреплены к эндоплазматической сети – мембранному органоиду, помогающему транспортировать определенные белки к цитоплазматической мембране. После образования белков HA и NA они вставляются в мембрану эндоплазматической сети (рис. 22). Затем эти белки переходят на поверхность клетки посредством маленьких везикул, которые в итоге сливаются с цитоплазматической мембраной. В результате HA и NA вставляются в липидную мембрану клетки в правильном направлении. Белок M2 отправляется к этому участку таким же образом.

Вирусные РНК с (-) нитью, которые впоследствии соберутся в новые вирусные частицы, производятся в ядре клетки, а замет переходят в цитоплазму. Эти РНК соединяются с вирусными белками PA, PB1, PB2 и NP. Вирусные белки, отличные от HA, NA и M2, производятся посредством трансляции на свободные рибосомы, как показано для M1. Белок M1 прикрепляется к мембране, в которую вставлены HA, NA и M2. Скопление, состоящее из вирусных РНК и вирусных белков (называемых рибонуклеопротеиновым комплексом – RNP), направляется к участку скопления. Затем вирион формируется в так называемом процессе почкования, в течение которого мембрана выступает из клетки и в итоге отсекается, чтобы образовать свободную частицу.

Когда новые вирионы возникали в процессе отпочкования, они должны немедленно присоединиться к рецепторам сиаловой кислоты на поверхности клетки, если этого не произошло для действия вирусного гликопротеина NA. Фермент удаляет сиаловые кислоты с поверхности клетки, так что вновь образовавшиеся вирионы могут быть высвобождены. Это требование объясняет принцип действия ингибиторов нейраминидазы Тамифлю и Реленза: они блокируют отделение сиаловой кислоты от поверхности клетки. В присутствии этих ингибиторов вирионы отпочковываются от поверхности клетки, но остаются прочно привязанными. Поэтому Тамифлю и Реленза блокируют инфекцию, предотвращая проникновение вновь синтезированных вирусных частиц в другие клетки.

4.2. Сборка сегментированного генома РНК гриппа

Геном РНК вирусов гриппа сегментирован. Вирионы вирусов гриппа A и B содержат 8 различных РНК, тогда как гриппа C – только 7. Как вставляется необходимое количество сегментов РНК во вновь синтезированные частицы вируса?

Во время скопления вируса гриппа вирусные РНК и вирусные белки, называемые рибонуклеопротеиновым комплексом – RNP, передвигаются к цитоплазматической мембране. Там вирион формируется в процессе почкования, во время которого мембрана выступает из клетки и в итоге отсекается для формирования свободной частицы.

Рисунок 23.

Производство инфекционной вирусной частицы требует внедрения как минимум одной копии каждого из восьми сегментов РНК. Для объяснения того, как вирион получает полный комплемент геномной РНК, были предложены два других механизма – неупорядоченная и выборочная сборка.

Если восемь сегментов вирусной РНК гриппа были неупорядоченно собраны в новые частицы, то мы, скорее всего, увидим одну инфекционную частицу на каждые 400 собранных частиц (8!/88). Этот коэффициент попадает в диапазон от инфекционных до неинфекционных частиц, встречающихся в линиях вирусов. Если в каждый вирион может быть собрано больше чем восемь сегментов РНК, тогда доля инфекционных частиц существенно возрастает. Например, если 12 молекул РНК могут подойти к каждому вириону, то 10% частиц будут иметь полный вирусный геном. Этот механизм подтверждается обнаруженными вирусами гриппа с более чем восьмью сегментами РНК.

При механизме выборочной сборки каждая из восьми геномных РНК имеет отличный от других сигнал, позволяющий входить в вирусные частицы. Считается, что эти сигналы находятся в некодирующих и кодирующих последовательностях на 5′- и 3′-концах вирусных РНК. Последовательности взаимодействуют и формируют структуры, уникальные по отношению к каждому сегменту и важные для внедрения каждого сегмента в вирионы. С этой гипотезой согласуются данные электронной микроскопии, показавшие, что во время почкования вирусные рибонуклеопротеины организуются в отдельные образцы, как показано на рис. 24.

Рисунок 24.

На основании этого наблюдения утверждается, что рибонуклеопротеины не случайным образом внедряются в вирионы. Также данное наблюдение согласуется с присутствием специфических сигналов в каждом сегменте РНК, позволяющем рибонуклеопротеинам собираться в виде полного набора. Механизмы, при которых распознаются эти сигналы, не известны, так же как и то, каким образом они обеспечивают вхождение одной копии каждого сегмента РНК в частицу.

Есть явное свидетельство для механизма отбора во время сборки бактериофага ψ6 генома. Вирусные частицы содержат одну копию каждого из сегментов S, M и L РНК. Все частицы содержат полный комплемент сегментов генома (это подтверждается тем фактом, что каждая вирусная частица инфекционна). Только сегмент S РНК может войти во вновь образовавшуюся частицу; как только этот сегмент собран, M РНК может войти. L РНК может войти лишь в частицы, содержащие оба сегмента S и M. Поэтому точная сборка является результатом периодической зависимости сборки сегментов РНК.

Рекомендуемая литература.

  • Muramoto, Y., Takada, A., Fujii, K., Noda, T., Iwatsuki-Horimoto, K., Watanabe, S., Horimoto, T., Kida, H., &Kawaoka, Y. (2006). Hierarchy among Viral RNA (vRNA) Segments in Their Role in vRNA Incorporation into Influenza AVirionsJournal of Virology, 80 (5), 2318-2325 DOI: 10.1128/JVI.80.5.2318-2325.2006.
  • Noda, T., Sagara, H., Yen, A., Takada, A., Kida, H., Cheng, R., &Kawaoka, Y. (2006). Architecture of ribonucleoprotein complexes in influenza A virus particles Nature, 439 (7075), 490-492 DOI: 10.1038/nature04378.
  • Frilander, M. (1995). In Vitro Packaging of the Single-stranded RNA Genomic Precursors of the Segmented Double-stranded RNA Bacteriophage ψ6: The Three Segments Modulate Each Other’s Packaging Efficiency Journal of Molecular Biology, 246 (3), 418-428 DOI: 10.1006/jmbi.1994.0096.

4.3. Рекомбинация генома вируса гриппа

Мутация – важный источник разнообразия РНК вируса, которое стало возможным благодаря подверженности ошибкам синтеза РНК. Вирусы с сегментированными геномами, такими как вирус гриппа, используют другой механизм для создания разнообразия – рекомбинацию.

Когда вирус гриппа инфицирует клетку, отдельные сегменты РНК входят в ядро. Там они много раз копируются, чтобы образовать геномы РНК для новых инфекционных вирионов. Новые сегменты РНК переходят в цитоплазму, а затем проникают в новые частицы вируса, которые отпочковываются от клетки (см. 4.1.).

Если клетка инфицирована двумя различными вирусами гриппа, в ядре копируются РНК обоих вирусов. Когда новые частицы вируса собираются на цитоплазматической мембране, каждый из восьми сегментов РНК может появиться из любого инфицирующего вируса. Потомство, наследующее РНК от обоих родителей, называется реассортантами. Этот процесс показан на рис. 25, где изображена клетка, коинфицированная двумя вирусами гриппа L и M. Зараженная клетка производит оба родительских вируса, так же как и реассортант R3, который наследует один сегмент РНК из штамма L и остаток из штамма M.

Рисунок 25.

Одним из примеров эволюционной важности рекомбинации является обмен сегментов РНК между вирусами гриппа млекопитающих и птиц, породивший пандемический грипп. Например, пандемический штамм H1N1 2009 – это реассортант вирусов птиц, человека и свиньи, как показано на рис. 26.

Рисунок 26.

Рекомбинация может происходить только между вирусами гриппа, относящимися к одному типу. Непонятно, почему вирусы гриппа A никогда не обмениваются сегментами РНК вирусов гриппа B или C. Возможно, причина связана с механизмом сборки, который гарантирует, что каждый вирион гриппа содержит хотя бы одну копию каждого сегмента РНК.

Рекомендуемая литература.

  • Trifonov, V., Khiabanian, H., & Rabadan, R. (2009). Geographic Dependence, Surveillance, and Origins of the 2009 Influenza A (H1N1) Virus New England Journal of Medicine DOI:10.1056/NEJMp0904572.

4.4. Рекомбинация вируса гриппа: прежние и современные методы

Рисунок 27.

В недавнем исследовании, посвященном рекомбинации вируса гриппа у хорьков, авторы использовали полимеразную цепную реакцию (ПЦР) для поиска вирусов с сегментами РНК из пандемического штамма H1N1 2009 г., а также сезонных штаммов H1N1 и H3N2. Думаю, вам может быть интересно, как я проводил подобный эксперимент в 1979 г. Это была совершенно другая эпоха лабораторных методов.

В процессе написания докторской диссертации я хотел выделить реассортанты двух штаммов вируса гриппа B: B/Lee и B/Maryland. Целью было получение вирусов с геномом, состоящим из одного сегмента РНК от одного родителя, и семи сегментов РНК от другого родителя. Эти вирусы впоследствии могли быть использованы для определения белкового продукта каждой вирусной РНК.

Для выделения этих реассортантов я коинфицировал клетки в культуре обоими вирусами, позволяя им размножаться, а затем собрал вновь синтезированные вирусы. После этого я провел анализ бляшкообразования вирусов, появившихся в процессе коинфицирования клеток, и выделил индивидуальные клоны путем очистки от бляшек. Я подготовил линию вирусов из каждого очищенного от бляшек клона, после чего задался вопросом, есть ли среди этих вирусов реассортанты.

В 1979 г. мы определяли вирусные реассортанты трудоемким методом. Каждый вирус, который нужно было исследовать, заражал культивируемые клетки в присутствии радиоактивного фосфата. Вирусы очищались центрифугированием, вирусная РНК извлекалась, концентрировалась и фракционировалась посредством гель-электрофореза. Гель высушивался, после чего делали его рентгеновский снимок. Поскольку вирусы размножались в присутствии радиоактивного фосфата, внедренного в вирусные РНК, мы имели возможность сделать видимым каждый вирусный сегмент в виде ленты на снимке. Снимок показан на рис. 27.

Использовались РНК трех различных вирусов: B/Lee – слева, B/Maryland – по центру и очищенный от бляшек вирус, называемый R3. Как и ожидалось, каждая дорожка содержала восемь РНК. Очевидно, что миграционное существование РНК различно для B/Lee и B/Maryland. Это свойство позволило нам определить, что очищенный от бляшек вирус R3 – это реассортант, который наследует РНК2 от B/Lee, а остающиеся семь РНК – от B/Maryland. То, что я и хотел.

На самом деле, при единственном заражении я выделил все различные реассортанты вирусов, которые мне были нужны. Я помню, как показал гель моему научному руководителю, и он сказал мне, что я не заслуживаю такой удачи.

Вся процедура – от инфицирования клеток в присутствии радиоактивного фосфата до производства рентгеновских лучей – заняла примерно неделю. И понадобилось немало удачи, чтобы получить все верные вирусные реассортанты.

Сегодня процесс определения вирусных реассортантов гриппа намного проще и быстрее. Начинается он схожим образом – с коинфицирования клеток (или животных) двумя разными вирусами. После заражения берется образец культурной среды клеток, разогревается для разрушения вирионов, и вирусная РНК преобразуется в ДНК с использованием обратной транскриптазы. ДНК увеличивается при ПЦР в восьми отдельных реакциях с использованием пар праймеров, специфичных для отдельных сегментов. Затем продукция фракционируется при гель-электрофорезе, как показано здесь.

Общее время для определения реассортантов при помощи ПЦР занимает меньше одного дня. Это действительно прогресс.

Через несколько лет мы откажемся от гель-электрофореза и просто определим последовательность РНК при помощи небольшого и недорогого механизма, который будет на большинстве лабораторных столов. И кто знает, что последует за этим? В этом одна из прелестей науки – она движется вперед благодаря технологическим инновациям.

Рекомендуемая литература.

  • Racaniello VR, & Palese P (1979). Influenza B virus genome: assignment of viral polypeptides to RNA segments. Journal of virology, 29 (1), 361-73 PMID: 430594.

опубликовано 24/01/2014 14:55
обновлено 24/01/2014
ОРЗ, Инфекционные болезни, Инфекционные болезни

Комментарии

Для того чтобы оставить комментарий, пожалуйста, войдите или зарегистрируйтесь.

Скачивайте наши приложения